Заботливый врач
Ключевым аспектом искусственного осеменения коров является практическая разработка долгосрочного сохранения спермы. Криоконсервация спермы часто возможна лишь в ограниченной степени из-за различной криотолерантности у разных видов животных и самцов одного вида.
Охлаждение спермы менее травматично для клеток, чем глубокое замораживание. Оплодотворяющая способность охлажденной спермы выше, чем криоконсервированной, но сохраняется она в течение нескольких суток, чем ограничивает использование.
Применение разбавителей для хранения спермы в охлажденном виде имеет ряд преимуществ:
- Сохранение морфофункциональной полноценности репродуктивных клеток длительное время с возможностью транспортировки семени на дальние расстояния, не прибегая к криоконсервации.
- Получение высокого процента жизнеспособных сперматозоидов по сравнению с замороженно-оттаянным семенем и, как следствие, высокий уровень продуктивных осеменений.
- Использование генетического материала быков особо ценных, редких и исчезающих пород крупного рогатого скота с низкой криорезистентностью семени для искусственного осеменения и восстановления поголовья.
Охлажденная сперма может использоваться при осеменении коров с удаленной охотой и задержкой овуляции. Так, исследования показали, что в случаях задержки овуляции использование охлажденной спермы приводило к более высокой оплодотворяемости (46,8%) по сравнению с осеменением замороженной спермой (27,7%, р = 0,017).
Авторы пришли к выводу, что оплодотворяющая способность охлажденной спермы в длительных интервалах от искусственного осеменения до овуляции может быть выше по сравнению с криоконсервированной и может быть эффективным инструментом для повышения плодовитости лактирующих молочных коров с задержкой овуляции.
Когда свежеэякулированные сперматозоиды быстро охлаждаются от температуры тела до температуры ниже 15 °C, применяемый холодовой шок приводит к разной степени потери жизнеспособности сперматозоидов в зависимости от вида, особенно если охлаждение продолжается очень быстро — до плюс 1–2 °C.
Чтобы предотвратить старение сперматозоидов во время консервации, необходимы специальные меры. Это включает в себя снижение метаболизма сперматозоидов с помощью снижения температуры. Принципы сохранения охлажденной спермы основаны на добавлении метаболических буферов (ЭДТА, HEPES, хлорид калия, цитрат натрия, бикарбонат натрия и др.), питательных веществ (глюкоза, фруктоза и др.) и защитных веществ (яичный желток, лецитин, молоко и т. д.), а также на подавлении роста бактерий путем добавления антибиотиков.
Условия хранения спермы могут влиять на ее качество в зависимости от типа используемого разбавителя, температуры хранения и продолжительности хранения. Сохраняемость разбавителей спермы при температуре охлаждения зависит от того, содержат ли они криопротекторы даже при кратковременном хранении.
Проникающие криопротекторы, такие как глицерин, проходят через клеточную мембрану и защищают клетку от повреждений, вызванных медленным замораживанием. Другие вещества могут действовать как криопротекторы по различным механизмам, включая желток, молочные белки, альбумин и липосомы. Эти вещества изменяют липидный состав клеточной мембраны, повышая ее проницаемость для проникающих криопротекторов и обеспечивая большую устойчивость к температурному шоку.
Было показано, что хранение при комнатной температуре в течение 72 часов влияет на подвижность в зависимости от используемого разбавителя. Несколько исследований были сосредоточены на влиянии замораживания и оттаивания на качество спермы, но лишь немногие исследователи изучали, как условия хранения влияют на ключевые параметры спермы при хранении в охлажденном виде, а не криоконсервированной.
Цель работы — оценка общей и прогрессивной подвижности и жизнеспособности спермы быков при охлаждении до 5°С и хранении в коммерческом и экспериментальном разбавителях.
Материалы и методы исследования
Исследование проводилось в 2024 г с использованием нативной спермы девяти быков черно-пестрой (n = 6) и айрширской пород (n = 3), содержащихся в АО «Невское» (г. Санкт-Петербург, Россия).
В опыте использовали быков-производителей в возрастной категории не моложе 3 лет.
Сперма быков отвечала стандартам ГОСТ 23745-2014, концентрация сперматозоидов в эякулятах составляла ≥ 700 млн/мл (фотометр, IMV Technologies, Франция).
Сперму получали на искусственную вагину. После получения каждый индивидуальный эякулят делился на две равные аликвоты для последующего внесения разбавителя. Разбавление проводили в соотношении 1:5 (одна часть спермы и пять частей разбавителя).
В опыте использовали два варианта разбавителей: в качестве контроля применяли коммерческий разбавитель OptiXcell (IMV) (Франция) (не содержит белков животного происхождения, промышленного производства, быстро готовится в производственных условиях и пользуется большой популярностью на племенных станциях), в качестве опыта — разработанный авторами экспериментальный разбавитель (на основе Триса).
После разбавления сперма помещалась в холодильную камеру при t 4 °C для экспонирования и последующей оценки переживаемости спермиев. Оценку проводили через 2 часа после разбавления и затем каждые 24 часа до полной гибели клеток в образце.
Исходя из графика временного распределения, образцы забирали на анализ для оценки качественных показателей репродуктивных клеток. Оценку проводили по показателям общей и прогрессивной подвижности сперматозоидов при помощи анализатора «Аргус-CASA» (Россия), оценку жизнеспособности спермиев — при помощи суправитального окрашивания клеток эозином и нигрозином.
Данный метод позволяет по цветовому распределению выявить процент клеток с интактными (бесцветными) и поврежденными (красными) мембранами.
В каждом образце оценивались не менее 200 клеток.
Эксперимент проводился с соблюдением требований, изложенных в Директиве Европейского парламента и Совета Европейского союза 2010/63/ЕС от 22 сентября 2010 года о защите животных, использующихся для научных целей, и принципов обращения с животными согласно статье 4 ФЗ РФ N 498-ФЗ.
Статистическую обработку проводили с помощью программы IBM SPSS Statistics 19 (США).
Результаты и обсуждение
Удлинение срока жизни сперматозоидов при понижении температуры связано с замедлением обмена веществ. Характерная черта сперматозоида — узкая специализация его функций. Созревший сперматозоид не может пополнять разрушения клеточных структур, вызванные обменом веществ.
Правильно подобранный разбавитель спермы и температура хранения смогут продлить жизнь половых клеток. Оплодотворяющая способность охлажденной спермы выше, чем криоконсервированной, поскольку клетки в цикле «замораживания — оттаивание» подвергаются негативному влиянию сверхнизких температур.
В России охлажденная сперма быков практически не применяется, разбавители для нее давно не совершенствовались. Однако в инструкциях по применению многих разбавителей зарубежного производства для замораживания спермы быков, например Minitube (Германия) и IMV (Франция), имеется пункт о возможности использования для охлажденной спермы.
Авторы провели оценку переживаемости и сохранности мембран сперматозоидов быков при разбавлении экспериментальным разбавителем и OptiXcell (IMV, Франция) при охлаждении и хранении при 5 °С.
Результаты оценки переживаемости представлены в таблице 1.
Из данных таблицы 1 видно, что нет достоверной разницы по общей и прогрессивной подвижности между исследуемыми разбавителями. В большинстве случаев сперматозоиды были живы в течение 10 суток.
Если учитывать прогрессивную подвижность 40% как минимально допустимую для искусственного осеменения, в среднем у исследуемых быков она оставалась такой при хранении до 120 часов. В то же время были отдельные эякуляты, которые имели прогрессивную подвижность 40% и выше и после 168 часов хранения.
При анализе литературных данных максимальное время хранения при 4–5 °С и применения для искусственного осеменения — 48 часов. При хранении спермы, разбавленной в экспериментальном разбавителе в течение 144 часов, средняя прогрессивная подвижность была 41,78 ± 7,65%, что соответствует допустимым параметрам для искусственного осеменения. Средняя прогрессивная подвижность в сперме, разбавленной OptiXcell, при хранении в течение 144 часов в данном опыте составила 35,00 ± 7,71%, что является допустимым параметром использования быков с высокой племенной ценностью, если в дозе для осеменения не менее 10 млн сперматозоидов с прогрессивной подвижностью.
Полученные данные по сохранности мембран сперматозоидов при хранении в охлажденном виде представлены в таблице 2.
Из представленных данных видно, что нет достоверных различий по этому показателю при разбавлении исследуемыми разбавителями. При хранении в течение 72 часов практически не было снижения количества интактных клеток при использовании экспериментального разбавителя. При хранении в течение 168 часов количество интактных клеток в обоих разбавителях было выше 41%.
Повышение показателей подвижности и количества сперматозоидов с интактными плазматическими мембранами напрямую влияет на фертильность гамет и последующее плодотворное оплодотворение.
Выводы
Результаты исследования показали сохранение биологической полноценности спермы в охлажденном виде при температуре 5 °С в течение 120 часов в двух разбавителях. В среднем прогрессивная подвижность была 55,00 ± 11,84% при разбавлении в экспериментальном экстендере, 51,33 ± 8,83% — в OptiXcell.
При хранении в течение 144 часов средняя прогрессивная подвижность сперматозоидов при использовании экспериментального разбавителя была 41,78 ± 7,65%, OptiXcell — 35,00 ± 7,71%, интактность клеток сохранялась на уровне 46,17 ± 2,61% и 43,00 ± 3,04% соответственно. При этом разброс значений по прогрессивной подвижности был от 0 до 68% в экспериментальном разбавителе, от 10 до 70% — в OptiXcell.
Установлено, что сперма одного быка при хранении в течение 192 часов имела прогрессивную подвижность 40% в обоих разбавителях. Это может свидетельствовать о положительной тенденции сохранения полноценности репродуктивных клеток при использовании экспериментального экстендера как среды для разбавления и хранения при 5°С.
Об авторах
Елена Владимировна Никиткина; кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник
nikitkinae@mail.ru; https://orcid.org/0000-0002-8496-5277
Николай Вячеславович Плешанов; научный сотрудник
klaus-90@list.ru; https://orcid.org/0000-0002-4634-7515
София Сергеевна Богданова; младший научный сотрудник
sonikbogdanova@mail.ru
Юлия Григорьевна Турлова; кандидат биологических наук, старший научный сотрудник
jturlova@gmail.com; https://orcid.org/0000-0001-9845-1421
Всероссийский научно-исследовательский институт генетики и разведения сельскохозяйственных животных — филиал ФГБНУ «Федеральный исследовательский центр животноводства — ВИЖ им. академика Л.К. Эрнста, Московское шоссе, 55А, Пушкин, Санкт-Петербург, 196601, Россия
УДК 636.082.453
DOI: 10.32634/0869-8155-2024-387-10-91-95
Просмотров: 183
Источник: https://agrarnayanauka.ru/sohranenie-biologicheskoj-polnoczennosti-spermatozoidov-bykov-pri-hranenii-spermy-v-ohlazhdennom-vide/
Source: https://lib.zaplata.ru/veterinar/sohranenie-biologicheskoi-polnocennosti-spermatozoidov-bykov-pri-hranenii-spermy-v-ohlajdennom-vide.html
Читайте также:
