Изучение динамики относительной экспрессии гена EGR1 в различных органах у радужной форели породы рофор

Выращивание радужной форели в аквакультуре представляет собой эффективное решение при производстве рыбной продукции, так как позволяет выращивать на одной площади большее количество особей. Высокая плотность посадки обеспечивает ряд технологических преимуществ такого способа ведения хозяйства по сравнению с использованием естественных водоемов.

Несмотря на очевидные положительные стороны искусственного разведения рыб, доля России в мировом производстве продуктов рыбоводства составляет всего 0,33%. Эффективное ведение рыбного хозяйства возможно при использовании пород рыб, адаптированных к таким условиям. В частности, в области форелеводства выведен целый ряд пород радужной форели, обеспечивающих высокую продуктивность.

В последние годы большое внимание уделяется молекулярно-генетическим технологиям, направленным на изучение организации генома рыб, выявления связи фенотипа с кишечной микробиотой, определением адаптивного потенциала и т. д.

Наряду с исследованиями полного генома на предмет выявления ассоциаций однонуклеотидных полиморфизмов (SNPs) с продуктивными признаками рыбы продолжаются исследования отдельных генов. Вклад некоторых генов у рыб в формирование фенотипа значительно выше, чем у млекопитающих, в связи с этим изучение генетики рыб является актуальной задачей. Известно, что гены, детерминирующие факторы транскрипции, обладают плейотропным эффектом, продукты этих генов регулируют экспрессию многих генов. Таким образом, исследование структуры и функций генов, связанных с морфогенезом рыб, является перспективным путем получения новых знаний, которые можно использовать как в фундаментальной науке, так и в прикладных работах.

Ген реакции раннего роста 1 (EGR1) регулирует транскрипцию генов, участвующих в ответных реакциях на факторы роста и повреждение ДНК, учувствует в процессах выживания, пролиферации и гибели клеток и иммунном ответе. Уже достаточно давно известно, что этот ген у рыб имеет высокую степень гомологии с геном EGR1 мышей, крыс и человека, за исключением повторяющегося нуклеотидного триплета, кодирующего на N-концевом участке соответствующий белок.

Ген EGR1 кодирует транскрипционный фактор, оказывающий влияние на транскрипцию большого числа генов как с 5-штрих, так и с 3-штрих конца генов. Более того, установлено, что около 9000 аннотированных генов содержат по крайней мере один комплементарный к данному гену участок в промоторной части. В частности, выявлена роль гена в окулогенезе у рыб при формировании хрусталика и дифференциации клеток сетчатки. Мутации в гене привели к задержке в развитии глаз. Ген EGR1 имеет высокую гомологию с участками генов, вовлеченных в передачу сигналов в синапсах нервных окончаний. Такие функциональные особенности белковых продуктов гена определяют его важность в поведении рыб в социальном аспекте.

Например, было установлено, что мутации в гене, снижающие его экспрессию, приводят к нарушениям социального поведения и ориентирования в пространстве у костистых рыб. Очевидно, нарушение социального поведения форели неизбежно негативно скажется на формировании живой массы при разведении рыбы. Это связано с нарушениями ориентации особей во время кормления, потерей естественных взаимоотношений между индивидуумами в популяции.

Исследования EGR1 проводили в основном на модельном объекте (zebrafish), поэтому изучение экспрессии гена у коммерчески выращиваемых пород форелевых рыб в аквакультуре представляет особый интерес.

Материалы и методы исследования

Биологический материал был собран в Федеральном селекционно-генетическом центре рыбоводства (п. Ропша, Ленинградская обл., Россия) в 2022 году.

Для исследования была выбрана форель радужная (Oncorhynchus mikiss W.) породы Рофор (рис. 1).

Для анализа относительной экспрессии гена EGR1 были взяты экземпляры рыбы разных возрастов (6 мес., 12 мес. и 18 мес.) по 5 штук в каждой группе. Образцы мышечной ткани, ткани сердца и прямой кишки были зафиксированы в РНК-стабилизирующем растворе («Евроген», Россия) (от 5 особей в каждой группе). От каждой особи были сняты метрические показатели (масса тела, г; длина по Смиту, см; длина до конца чешуйчатого покрова, см; длина головы, см; высота тела, см; мышечная масса, г; масса кишечника, г; масса сердца, г) с помощью мерной доски и угольной линейки (рис. 2).

Перед работой каждую особь погружали в воду с добавлением небольшого количества эфирного масла гвоздики.

Измельчение образцов ткани проводилось на гомогенизаторе BertinPrecellys 24 (BertinTechnologies, Италия) в пробирках с укрепленными стенками и металлическими шариками диаметром 2 мм. Выделение тотальной РНК выполняли с помощью коммерческого набора «ЛИРА+» от компании «Биолабмикс» («Биолабмикс», Россия) согласно инструкции производителя. Полученные образцы РНК хранили в низкотемпературной морозильной камере (DW-HL528SA, Meling, Китай) при температуре -80 °C. Все манипуляции с РНК проводились на льду для недопущения распада молекулы. Концентрацию и качество РНК оценивали с помощью спектрофотометра NanoDrop 2000С ThermoFisher (Thermo Scientific, США).

Для оценки относительного уровня экспрессии использовался метод ПЦР в режиме реального времени с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР-РВ). Синтез КДНК из полученных образцов РНК осуществляли с помощью раствора: 500 нг/мл РНК, 1 мкл ДНКазы согласно инструкции производителя, 1 мкл буфера MgCl2 и объем раствора доводили до 9 мкл водой, свободной от РНКаз и ДНКаз. Полученный раствор инкубировали в твердотельном термостате ТТ-2 («ДНК-Технология», Россия) 30 минут при температуре 37°C.  Для остановки действия ДНКазы в раствор добавляли 1 мкл 50 миллимолярного раствора ЭДТА и инкубировали 10 мин. при температуре 65 °C. После этого к полученному раствору добавляли по 1 мкл прямого и обратного праймера и инкубировали 2 мин. при 70 °C. Ревертазу использовали от компании «Биолабмикс» (г. Москва, Россия). По протоколу производителя был подготовлен микс, содержащий 0,5 мкл ревертазы, 3,5 буфера, объем доводили водой, свободной от РНКаз и ДНКаз, до 8 мкл. К раствору, содержащему РНК, добавляли 10 мкл полученного микса с ревертазой. Амплификацию проводили в соответствии с протоколом: 60 мин. 42 °C, 10 мин. 70 °C.

Для оценки уровня экспрессии гена EGR1, расположенного на 14-й хромосоме, был взят ген «домашнего хозяйства» G6PD (табл. 1). Ген G6PD учувствует в углеводном обмене и метаболизме глюкозы. Праймеры к генам «домашнего хозяйства» и гену EGR1 представлены в таблице 1.

Для проведения ПЦР в режиме реального времени использовали коммерческий набор 5X qPCRmix-HS SYBR от компании «Евроген» (SYBRGreen, Россия).

Перед постановкой ПЦР в режиме реального времени полученные образцы КДНК разбавлялись в 5 раз. Реакционную смесь готовили согласно протоколу производителя. Конечный объем готового раствора составлял 12,5 мкл. Каждый образец ставился в трех повторностях.

Для проведения ПЦР в режиме реального времени использовался прибор CFX96 Touch (Bio-Rad, США).

Расчет экспрессионных изменений проводился относительно образца КДНК, который был синтезирован из образцов РНК мышечной ткани рыб. Протокол проведения реакции амплификации образцов КДНК: 95,0 °C 5 мин., 40 циклов: 95 °C 15 сек., 60,0 °C 15 сек. и детекция сигнала 72,0 °C 30 сек.

Экспрессионные изменения гена EGR1 рассчитывали с помощью метода ddCt (delta delta Cycle threshold), разработанного K.J. Livak и др. по формуле:

Статистически обработанные данные представлены в виде: среднее значение ± стандартное отклонение. Для оценки статистически значимой разницы использовался критерий Краскела — Уоллиса. Полученные результаты были визуализированы в программе Microsoft Excel (США). Для проведения корреляционного анализа использовался критерий Спирмена.

Результаты и обсуждение

В результате анализа экспрессионных изменений гена EGR1 в тканях прямой кишки выявили динамику падения экспрессии с возрастом у радужной форели (рис. 3).

Уровень относительной экспрессии в возрасте 6 мес. был максимальный, а в возрасте 18 мес. — минимальный, но достоверных различий не было выявлено (р = 0,2648).

Анализируя корреляционные связи (табл. 2), была выявлена высокая положительная корреляция (0,945) экспрессии гена EGR1 в ткани прямой кишки с относительной экспрессией в тканях сердца у группы 12-месячного возраста (р < 0,05).

Остальные данные не были достоверно значимыми. Хотя значения корреляций в основном были положительными, некоторые показатели были близки к 0 (высота тела и толщина тела с экспрессией гена EGR1 в прямой кишке в группе особей в возрасте 6 мес., масса сердца и масса прямой кишки с экспрессией гена в прямой кишке в группе особей в возрасте 18 мес.).

Высокий отрицательный коэффициент корреляции был между показателями длины головы и длины по Смиту с экспрессией гена EGR1 в тканях прямой кишки (-0,841 и -0,594).

В результате анализа изменений уровня относительной экспрессии гена EGR1 в тканях сердца радужной форели в разном возрасте установлено: у группы рыб возраста 6 мес. уровень экспрессии гена EGR1 был максимальным в сравнении с особями возраста 12 мес. и 18 мес. (рис. 4) (р < 0,01).

Анализ корреляционных связей относительного уровня экспрессии гена EGR1 в ткани сердца с некоторыми размерно-весовыми показателями рыб представлен в таблице 3.

В результате анализа корреляций была выявлена отрицательная зависимость уровня относительной экспрессии гена EGR1 с показателями «масса тела» и «толщина тела» в возрасте особи 6 мес. (р < 0,05). Кроме того, была отмечена положительная корреляция между экспрессией гена в прямой кишке и экспрессией гена в тканях сердца (0,945) при р < 0,05 в возрасте особи 12 мес.

Высокая отрицательная корреляция отмечена между длиной головы и экспрессией в тканях сердца (-0,951, р < 0,05) в возрасте 18 мес. Кроме того, в возрасте 18 мес. была отрицательная корреляция между массой тела и длиной тела по Смиту с экспрессией в тканях сердца. В остальных случаях отмечается положительный коэффициент корреляции, однако достоверных данных не было.

Выводы

Сравнительный анализ экспрессионных изменений гена EGR1 у радужной форели породы Рофор в разном возрасте в тканях сердца и прямой кишке выявил, что относительный уровень экспрессии гена EGR1 снижался в тканях сердца у рыб, снижался с возрастом и к 18 мес. имел минимальное значение (р < 0,05).

Эти данные можно объяснить важной ролью белка EGR1 как транскрипционного фактора в росте и развитии рыбы. Накопление массы происходит наиболее интенсивно именно в раннем возрасте (до 6 мес.), и этот процесс, вероятно, обусловлен повышенной транскрипцией гена EGR1. Наличие отрицательных корреляций между экспрессией изучаемого гена в сердце и рядом размерно-весовых показателей указывает на роль других транскрипционных факторов, влияющих на формирование таких показателей. Относительный уровень экспрессии гена EGR1 втканях прямой кишки с возрастом снижался, однако достоверных данных получено не было.

Об авторах

Юрий Сергеевич Щербаков; кандидат биологических наук, младший научный сотрудник

yura.10.08.94.94@mail.ru; https://orcid.org/0000-0001-6434-6287

Ольга Анатольевна Николаева; младший научный сотрудник

trantoburito@mail.ru; https://orcid.org/0000-0003-3828-1111

Валентина Ивановна Тыщенко; кандидат биологических наук, старший научный сотрудник

tinatvi@mail.ru; https://orcid.org/0000-0003-4964-9938

Всероссийский научно-исследовательский институт генетики и разведения сельскохозяйственных животных — филиал Федеральный исследовательский центр животноводства — ВИЖ им. академика Л.К. Эрнста», Московское шоссе, 55А, Пушкин, Санкт-Петербург, 196601, Россия

УДК 639.3.05
DOI: 10.32634/0869-8155-2024-386-9-77-81

Просмотров: 92